Accadde trent’anni fa esattamente non ricordo il giorno ma era primavera, la stagione che cambia e crea un’atmosfera, e tra tanti flaconi d’insulina risalenti ancora al buon metodo Banting avvenne un cambiamento che sorprese tutti quanti, l’arrivo dell’insulina derivata dal DNA ricombinante in sistemi batterici, o più comunemente detta umana: si sa la terapia del diabete è vecchia come il cucco – tra un po’ celebreremo i cent’anni del farmaco, ma anche gli ipoglicemizzanti orali impiegati per il diabete tipo 2 sono una creazione farmacologica ancora più recente – risalgono agli anni 60. Ricordo proprio sul finire di quel decennio, quando ancora i diabetologi bolognesi tentavano nuove terapie e facevano sperimentazione (diabetologia allora era ancora cattedra universitaria della Facoltà di Medicina), mi fecero testare una delle compresse storiche: il glucophage, naturalmente per il diabete di tipo 1 era come dare aria fresca, ovvero non produsse alcun beneficio.
Grazie all’avvento dell’era biotecnologica è possibile produrre l’insulina tramite modificazione enzimatica dell’insulina prodotta dal maiale o tramite tecnologia del DNA ricombinante in sistemi batterici.
L’insulina si ottiene con la tecnologia del DNA ricombinante dal 1982, quando negli Stati Uniti fu messo a punto un sistema batterico in E. coli. L’insulina è collegata al primo brevetto e al primo farmaco biotecnologico, messo in commercio. La strategia di clonazione prevede la produzione delle catena A e B separatamente. È stata sintetizzata l’informazione per la catena A, fondendo la sequenza nucleotidica con il gene lacZ nel plasmide pBR322, vettore di clonazione in E. coli. nel punto di fusione tra lacZ e l’informazione relativa alla catena A è stato inserito il codone codificante l’amminoacido metionina.
La catena B è, invece, stata sintetizzata in due tempi: prima è stata sintetizzata la porzione N-terminale con procedimento analogo a quello seguito per la catena A; poi è stata sintetizzata la porzione C-terminale con lo stesso procedimento. In seguito all’espressione di tali geni in E. coli si sono isolati i frammenti codificanti la catena, sono stati fusi col gene lacZ inserendo nel punto di fusione l’amminoacido metionina.
L’utilizzo del sistema lacZ/ beta-galattosidasi ha numerosi vantaggi:
il sistema è inducibile.
le catene vengono sintetizzate in fusione con la beta-galattosidasi, che svolge un’azione protettiva nei confronti della demolizione proteolitica.
I due peptidi vengono trattati quindi con bromuro di cianogeno, un agente chimico capace di scindere i peptidi con taglio proteolitico in corrispondenza dell’amminoacido metionina. Non resta, quindi, che purificare i prodotti di sintesi e di mescolare le due catene, permettendo la formazione spontanea dei ponti disolfuro.
Inoltre, l’insulina in soluzione è in equilibrio tra forma dimera ed esamera. In presenza di zinco assume forma esamera, diventando un complesso cristallino od amorfo più stabile ma insolubile, quindi di più lento assorbimento. La forma cristallina viene assorbita più lentamente ed è nota come “insulina ultralenta” e la sua azione appare dopo circa 36 ore; la forma amorfa è nota come “insulina semilenta”, viene assorbita più rapidamente e la sua azione ha una durata di soli 12-16 ore.
I produttori d’insulina presentano diverse forme commerciali, differenti in composizione e modalità di azione. Tuttavia, la sintesi mediante l’utilizzo di batteri è molto scomoda, per diversi motivi. Primo tra tutti la difficoltà di assemblaggio (con conseguente bassa resa) delle due catene, dato che questi microorganismi, essendo procarioti, non possiedono tutto il macchinario di modificazione e secrezione necessario per una proteina oltretutto tipicamente degli eucarioti superiori. E poi vi sono gli alti costi per la sua purificazione. Tutto ciò può essere aggirato utilizzando i lieviti come organismi bio-reattori: essendo eucarioti, quindi provvisti di reticolo endoplasmico e apparato del Golgi altamente sviluppati, non avranno problemi ad assemblare correttamente e a secernere la proteina d’interesse.
Per tirare le somme, e lo faccio da testimone del tempo intercorso dall’insulina animale a quella ricombinante: grazie a questa ultima tipologia e evoluzione del farmaco si è potuto migliorare l’assetto della terapia e il compenso della glicemia. Ora aspettiamo che diventi realtà l’insulina per via orale così come controlli della glicemia non invasivi e affidabili al tempo stesso.