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Gli scienziati dell’Istituto Salk modificano il CRISPR per trattare epigeneticamente diabete, malattie renali, distrofia muscolare

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Gli scienziati dell’Isituto Salk hanno creato una nuova versione della tecnologia di editing del genoma CRISPR / Cas9 che consente di attivare i geni senza creare interruzioni nel DNA, aggirando potenzialmente un ostacolo importante all’utilizzo di tecnologie di modifica genetica per curare le malattie umane.

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La maggior parte dei sistemi CRISPR / Cas9 funziona creando “interruzioni a doppio filamento” (DSB) in regioni del genoma destinate al montaggio o alla cancellazione, ma molti ricercatori sono contrari a creare tali interruzioni nel DNA degli esseri umani viventi. Come prova del concetto, il gruppo Salk ha usato il loro nuovo approccio per trattare diverse malattie, tra cui diabete, la malattia renale acuta e distrofia muscolare, nei modelli murini.

“Sebbene molti studi abbiano dimostrato che CRISPR / Cas9 può essere applicato come un potente strumento per la terapia genica, crescono le preoccupazioni riguardo alle mutazioni indesiderate generate dalle rotture del doppio filamento attraverso questa tecnologia”, afferma Juan Carlos Izpisua Belmonte, professore del Salk Gene Expression Laboratory e autore senior del nuovo documento, pubblicato su Cell il 7 dicembre 2017. “Siamo stati in grado di aggirare questa preoccupazione.”

Nel sistema originale CRISPR / Cas9, l’enzima Cas9 è accoppiato con gli RNA guida che lo indirizzano nel punto giusto del genoma per creare DSB. Recentemente, alcuni ricercatori hanno iniziato a usare una forma “morta” di Cas9 (dCas9), che può ancora indirizzare specifici posti nel genoma, ma non taglia più il DNA. Invece, dCas9 è stato accoppiato con domini di attivazione trascrizionale – interruttori molecolari – che attivano geni mirati. Ma la proteina risultante – dCas9 collegata agli interruttori attivatori – è troppo grande e ingombrante per adattarsi al veicolo tipicamente utilizzato per fornire questo tipo di terapie alle cellule negli organismi viventi, vale a dire i virus adeno-associati (AAV). La mancanza di un sistema di consegna efficiente rende molto difficile l’uso di questo strumento nelle applicazioni cliniche.

La squadra di Izpisua Belmonte ha unito Cas9 / dCas9 con una serie di diversi interruttori attivatori per scoprire una combinazione che ha funzionato anche quando le proteine ??non erano fuse l’una con l’altra. In altre parole, Cas9 o dCas9 sono stati impacchettati in un unico AAV e gli switch, gli RNA guida sono stati impacchettati in un altro. Hanno anche ottimizzato gli RNA guida per assicurarsi che tutti i pezzi finissero nel punto desiderato nel genoma e che il gene mirato fosse fortemente attivato.

“I componenti lavorano tutti insieme nell’organismo per influenzare i geni endogeni”, dice Hsin-Kai (Ken) Liao, un componente dello staff di ricerca nel laboratorio Izpisua Belmonte e co-autore del nuovo articolo. In questo modo, la tecnologia opera in modo epigenetico, il che significa che influenza l’attività dei geni senza modificare la sequenza del DNA.

Per testare il metodo, i ricercatori hanno utilizzato modelli murini di danno renale acuto, diabete di tipo 1 e una forma di distrofia muscolare. In ciascun caso, hanno ingegnerizzato il loro sistema CRISPR / Cas9 per potenziare l’espressione di un gene endogeno che potrebbe potenzialmente invertire i sintomi della malattia. Nel caso della malattia renale, hanno attivato due geni noti per essere coinvolti nella funzione renale e hanno osservato non solo un aumento dei livelli delle proteine ??associate a tali geni, ma anche una migliore funzionalità renale a seguito di una lesione acuta. Per il diabete di tipo 1, miravano a potenziare l’attività dei geni che potevano generare cellule produttrici di insulina. Ancora una volta, il trattamento ha funzionato, abbassando i livelli di glucosio nel sangue in un modello murino di diabete. Per la distrofia muscolare, i ricercatori hanno espresso geni che si sono stati precedentemente mostrati per invertire i sintomi della malattia,

“Eravamo molto emozionati quando abbiamo visto i risultati nei topi”, aggiunge Fumiyuki Hatanaka, un ricercatore associato in laboratorio e coautore dello studio. “Possiamo indurre l’attivazione dei geni e allo stesso tempo vedere cambiamenti fisiologici”.

Il team di Izpisua Belmonte sta ora lavorando per migliorare la specificità del proprio sistema e applicarlo a più tipi cellulari e organi per trattare una gamma più ampia di malattie umane, nonché per ringiovanire organi specifici e invertire il processo di invecchiamento e le condizioni legate all’età come la perdita dell’udito e la degenerazione maculare. Saranno necessari ulteriori test di sicurezza prima delle prove sugli umani, dicono.



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