EASD2021

#EASD2021 I ricercatori superano il divario traslazionale sviluppando un nuovo modello in vivo per l’etichettatura dei pool di granuli secretori di insulina

Un nuovo modello in vivo per l’etichettatura dei pool di granuli secretori di insulina
CREDITO: PLID
RESTRIZIONI D’USO: Figura creata con BioRender.com © PLID

Le cellule beta pancreatiche producono, immagazzinano e secernono insulina quando i livelli di glucosio nel sangue sono elevati. Tuttavia, il processo altamente regolato della secrezione di insulina, in particolare le sue caratteristiche molecolari e gli stimoli alla base di questo processo, non sono ancora stati completamente compresi. Inoltre, l’attuale comprensione della funzione delle cellule beta deriva principalmente da studi su   isole isolate ex vivo in modelli di roditori. Per superare questa lacuna traslazionale e per studiare il turnover dei granuli secretori di insulina  in vivo , un gruppo di ricerca nazionale sotto la guida di scienziati dell’Istituto Paul Langerhans dell’Helmholtz Zentrum München presso l’Ospedale universitario Carl Gustav Carus e la Facoltà di Medicina della TU Dresda (PLID ) e la LMU di Monaco di Baviera hanno generato un modello di suino transgenico che consente per la prima volta  marcatura fluorescente in vivo di pool di granuli secretori di insulina distinti per età, fornendo quindi una lettura vicina alla vita del turnover dell’insulina in condizioni normoglicemiche. I risultati di questo progetto altamente collaborativo sono stati pubblicati sulla rinomata rivista  </strong></span><em><span><a href="https://www.pnas.org/content/118/37/e2107665118" target="_blank" rel="noopener">Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS)</a> </span></em><strong><span>, data la probabilità che questo nuovo modello animale di grandi dimensioni vicino all’uomo fornisca informazioni sulla turnover di pool di insulina in condizioni fisiologiche e patologiche simili al diabete di tipo 2 umano.  

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La disfunzione delle cellule beta pancreatiche è un fattore chiave per il diabete di tipo 2 (T2D), una malattia che colpisce diverse centinaia di milioni di persone in tutto il mondo. Ogni cellula beta immagazzina insulina in diverse migliaia di organelli chiamati granuli secretori di insulina (SG), che rilasciano insulina a livello extracellulare quando la glicemia è elevata, come dopo un pasto. Sorprendentemente, viene rilasciata solo una piccola frazione dell’insulina SG e preferibilmente quelle che sono state prodotte più di recente. Finora, tuttavia, la nostra comprensione dei principi che regolano il turnover dell’insulina SG rimane molto rudimentale e deriva esclusivamente da   esperimenti ex vivo utilizzando isole pancreatiche isolate da, ad esempio, modelli murini geneticamente modificati o  in vitro lavorare con linee cellulari che producono insulina. Recentemente sono stati resi disponibili suini transgenici che consentono di condurre ricerche sulle cellule beta in un contesto ancora più vicino all’uomo.

In questo nuovo studio, i ricercatori descrivono la generazione e la caratterizzazione di un modello di suino transgenico chiamato SOFIA ( S tudy  OF  I nsulin granule  Aging). “Il primo passo nel processo di generazione è stata la fusione di un tag SNAP nel gene dell’insulina, che consente l’etichettatura condizionale e flessibile di pool di SG di insulina definiti dall’età con fluorofori di diversi colori su intervalli di tempo più lunghi”, spiega la dott.ssa Elisabeth Kemter del Wolf lab del LMU Gene Center, uno dei primi coautori dello studio. “Successivamente, abbiamo dovuto trasfettare questo vettore in cellule di maiale. Questi sono stati utilizzati per il trasferimento nucleare di cellule somatiche per produrre embrioni che sono stati successivamente trasferiti in scrofette sincronizzate con l’estro. Successivamente, abbiamo identificato il maiale SOFIA con il più alto tasso di espressione di INS-SNAP nelle cellule beta, che è stato successivamente utilizzato per impostare la linea di suini per i seguenti ulteriori esperimenti.

Utilizzando l’immunocolorazione e la microscopia confocale per il tag SNAP e l’insulina, gli scienziati hanno mostrato la colocalizzazione di SNAP con l’insulina nelle isole di Langerhans e hanno determinato il sito di integrazione del transgene mediante amplificazione del locus mirata (TLA) con successivo sequenziamento di nuova generazione (NGS). “Abbiamo localizzato il transgene in un singolo locus in una regione non codificante sul cromosoma 11 e caratterizzato ulteriormente i livelli di espressione e la localizzazione di INS-SNAP a livello cellulare”, afferma il dott. Andreas Müller del laboratorio Solimena al PLID. “Nel complesso, l’ultrastruttura delle cellule beta dei maiali SOFIA era paragonabile a quella dei maiali che non esprimevano insulina-SNAP e gli SG di insulina, i mitocondri e il reticolo endoplasmatico apparivano normali senza alcun segno di stress o alterazioni strutturali. E soprattutto, i test di tolleranza al glucosio non hanno rivelato differenze evidenti nella clearance della glicemia di SOFIA rispetto ai suini selvatici e anche i livelli di insulina plasmatica erano comparabili tra i due gruppi. Potremmo quindi dimostrare che l’applicazione sequenziale di due coloranti SNAP di diverse lunghezze d’onda ha prodotto pool di SG di insulina di diversi colori. In definitiva, il nostro sistema ci consente di seguire il turnover dell’insulina in un ambiente vicino alla vita”. 

Con questo maiale transgenico generato e caratterizzato con successo, il team di ricerca ha compiuto un passo significativo verso il superamento di due importanti limiti dell’attuale ricerca sulle cellule beta: il divario traslazionale tra roditori e umani ed  ex vivo esperimenti per il turnover dell’insulina utilizzando isole pancreatiche isolate. Soprattutto il primo punto è rilevante, poiché il modello del maiale transgenico sta colmando questo divario traslazionale, perché, i) i maiali sono simili agli umani nell’anatomia del loro tratto gastrointestinale e nella morfologia e funzione del pancreas, ii) è stato dimostrato che la struttura e la composizione delle isole pancreatiche del maiale è molto più vicina all’uomo che alle isole dei roditori e iii) le firme molecolari e di sviluppo delle isole/beta cellule di maiale e umane sono anche più simili tra loro rispetto a quelle dell’uomo e dei roditori.

Nel loro insieme, il maiale è un organismo modello convincente non solo per lo studio del metabolismo sistemico, ma in particolare anche per quello delle isole e della funzione delle cellule beta. Gli studi futuri mireranno ora all’ottimizzazione della somministrazione del colorante di etichettatura alle cellule beta e alla marcatura dell’insulina SG prodotta in tempi diversi. Alla fine, il maiale SOFIA sarà incrociato con altri modelli di suini diabetici disponibili per ottenere informazioni sui cambiamenti nel turnover di SG di insulina nel T2D. 

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